哥伦比亚大学研发出提高双光子显微镜成像通量的新技术卫生间

05-15

哺乳动物的大脑由多达几百亿神经元组成。神经元的功能并非相互独立，多数脑功能由神经元集群（neuronal ensemble）实现；多个神经元共同编码可以实现的功能大于仅仅简单相加单个神经元功能。为了研究神经元集群的功能，我们需要同时观测一群神经元的活动。传统双光子成像技术（two-photon microscopy）可以在单细胞层面记录神经元群体的活动，此技术通过激光对样品进行扫描，逐点收集样品的荧光信号。它虽然具有比较高的信噪比，而且可以对深层的组织进行成像，但它的成像通量比较低，一般无法对多个二维平面进行成像。

2019年5月14日，美国哥伦比亚大学韩舒婷教授、杨暐健教授在Cell Reports上发表文章Two-Color Volumetric Imaging of Neural Activity of Cortical Columns，提出了一个提高双光子显微镜成像通量的新技术。

研究人员通过用不同激光波长并行化激光扫描（wavelength multiplexing），增加了相同时间内可以成像的体积，并同时保持较高的时间和空间分辨率。通过引入两种波长不同的钙信号荧光探针，研究人员将神经元群体的活动标记为两个不同颜色，并同时用两个不同波长的激光激发探针，实现了两个颜色的并行化数据记录。为了实现三维空间成像，研究人员还分别在两个激光光路上配置了快速变焦系统，分别为电可调节透镜（electrical tunable lens）和空间光调制器（spatial light modulator）。由此，可以同时以10赫兹的速度记录500微米500微米的10个平面，覆盖纵深达600微米，涵盖了从脑皮层第2层到第5层的结构，体积内记录到的神经元可以达到2000个以上。

研究人员利用此技术研究清醒小鼠初级视觉皮层内的神经元群体的共同编码性质（emergent properties），以及神经元集群的结构和功能特性，还可以同时记录不同神经元群体的活动，例如小鼠视皮层第1层树突活动和第2/3层细胞体活动，以及从其他脑区例如前额叶皮层（prefrontal cortex）投射到视皮层的轴突活动和视皮层第2/3层细胞体在同一个三维体积里的活动。这也为研究两个神经元群体或者两个脑区间的相互作用提供了一种新的方法。

总之，这项研究不仅提供了一种新的三维高成像通量双光子钙成像方法，还为研究跨结构、跨区域的大规模神经元间的相互作用提供了基础。这项方法也与许多其他双光子钙成像技术兼容，结合起来可以更加提高成像体积及速度。

新型双光子显微镜带有的超高灵敏度的直接探测器能记录组织深层最细微的内部结构。多达7个的外置通道以及光谱拆分软件充分支持多色的多光子实验。再结合高速12kHz扫描头和最大扫描视野，将轴向位移减至最小，有效地收集来自深层组织的微弱光子，使图像更明亮，将对标本的光毒性减至最小。

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其频率可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

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